如何检测蛋白是否发生磷酸化


有磷酸化的抗体，
磷酸化抗体可以识别蛋白质的磷酸化或者非磷酸化形式，而且可以在避免放射污染的情况下，对磷酸化蛋白进行定性和定量分析，因此特异性磷酸化抗体是研究蛋白质磷酸化的重要工具。





检测磷酸化


请参见Kim HJ, Song EJ, Lee KJ. Proteomic analysis of protein phosphorylations in heat shock response and thermotolerance. J Biol Chem, 2002, 277 (26): 23193-23207.[


如何做蛋白的体外磷酸化


嗯，磷酸化蛋白的抗体一定要选好，最好不要买santa的，可以买upstate的,就是millipore的，或者abcam的。
第一，血清成分复杂，最好用密理博的Montage
Albumin
Deplete
Kit去除血清里50%的白蛋白
第二，磷酸化蛋白提取蛋白的时候，最好加入原钒酸钠，和磷酸酶抑制剂，防止蛋白脱磷酸化。
第三，不要用牛奶做封闭剂，用BSA。因为牛奶中含有磷酸化酪蛋白，防止非特异带。
第四，如果条带杂带多，而且，条带弱，可以选择millipore的signal
boost，增加条带特异性，而且，增强条带的亮度。